22 Junio 2017
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Estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección de Strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal

Laura F. Campo-Polanco MSc1, José M. Hernández-Sarmiento PhD2, Luz E. Botero-Palacio PhD3, Lina A. Gutiérrez-Builes PhD4

 

Introducción: el diagnóstico de estrongiloidiasis se realiza de rutina en los laboratorios clínicos; sin embargo, su detección se dificulta debido a la baja excreción parasitaria y la baja sensibilidad de las pruebas parasitológicas empleadas. Objetivo: diseñar y estandarizar una PCR en tiempo real (qPCR) para la detección de ADN de Strongyloides stercoralis en muestras de materia fecal. Materiales y métodos: se establecieron las condiciones de qPCR y se evaluaron: a) la especificidad analítica mediante análisis BLASTn de secuencias obtenidas de muestras positivas para Strongyloides stercoralis, b) sensibilidad analítica mediante diluciones seriadas de muestras que contenían larvas de Strongyloides stercoralis y c) la ocurrencia de reacciones cruzadas con otros parásitos e inhibidores de la amplificación. Resultados: se amplificó un fragmento de 101 pb del gen 18S del ARN ribosomal. El valor de Ct osciló entre 23 y 29, tomando un Ct ≤35 como el punto de corte para muestras positivas. El análisis BLASTn de las secuencias obtenidas mostró un porcentaje de identidad del 98% con secuencias 18S del ARN ribosomal de Strongyloides stercoralis reportadas en la NCBI. El límite inferior de detección de la qPCR fue 0,9 ng/μL. No se evidenció reacción cruzada con Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Uncinarias, Hymenolepis nana, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Giardia intestinalis e Iodamoeba bütschlii. No se detectaron inhibidores en las muestras de materia fecal. Conclusiones: la sensibilidad y la especificidad analítica de la qPCR comparado con el examen directo de heces son del 100%; sin embargo, aún no es posible interpretar su utilidad clínica.
 
Introduction: the diagnosis of strongyloidiasis is performing routinely in clinical laboratories; however, its detection is difficult due to low parasitic excretion and low sensitivity of the parasitological tests employed. Objective: to design and standardize a real-time PCR (qPCR) for the detection of Strongyloides stercoralis DNA in stool samples. Materials and methods: qPCR conditions were established and it were assessed: a) analytical specificity by BLASTn analysis of sequences obtained from samples positive for Strongyloides stercoralis, b) analytical sensitivity by serial dilutions of samples containing Strongyloides stercoralis larvae and c) the occurrence of cross-reactions with other parasites and amplification inhibitors. Results: a 101 bp fragment of the 18S ribosomal RNA gene was amplified. The value of Ct ranged from 23 and 29, with a Ct value ≤35 as a cut-off point for positive samples. BLASTn analysis of the obtained sequences showed an identity percentage of 98% with 18S ribosomal RNA sequences of Strongyloides stercoralis reported in the NCBI. The qPCR lower limit of detection was 0.9 ng/ μL. There was no cross-reaction with Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Uncinarias, Hymenolepis nana, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Giardia intestinalis, and Iodamoeba bütschlii. No inhibitors were detected in the stool samples. Conclusion: the sensitivity and analytical specificity of qPCR compared to direct examination of feces are 100%; however, it is still not possible to interpret their clinical utility.